Hitta hit:
T-bana: Universitetet
Frescativägen 40

Ordinarie öppettider:
Tisdag-söndag 10-18


  • Huvudmeny

Felkällor

Några vanliga fel och hur man undviker dem

 

 

Även om DNA-analyser bygger på den senaste tekniken och man följer instruktionerna till punkt och pricka, så finns det ändå utrymme för fel. Här ger vi därför några exempel på saker som kan sätta käppar i hjulet för ens analyser, eller ge fel resultat.

 

Det händer ibland att prover blandas ihop eller att DNA från andra källor hamnar i ens prov. Illustration: Erik Ersmark

Det händer ibland att prover blandas ihop eller att DNA från andra källor hamnar i ens prov. Illustration: Erik Ersmark

 

Kontaminering

Vi har tidigare nämnt att det är viktigt att hålla så rent som möjligt vid provtagning och i labbet. Anledningen är att man vill undvika kontaminering, det vill säga att material från andra organismer eller individer hamnar i ens prov. Skulle detta ske, riskerar man helt enkelt att analysera fel DNA.

Alla prover innehåller dock en viss blandning av DNA, med bidrag från miljön runt omkring, exempelvis från mikroorganismer och från oss själva. När det gäller miljöprover består de ju nästan helt av blandat material, som kommer från olika organismer. Att få fram DNA från bara en av dessa är däremot ingen omöjlighet, så länge det finns i tillräcklig mängd.

Själva urvalet av DNA görs i laboratoriet med hjälp av primersöppnas i nytt fönster, som kan utformas för att binda till specifika DNA-sekvenser. I bästa fall utesluts därmed allt annat DNA, men det händer också att primers binder till DNA från närbesläktade arter eller till och med från mikroorganismer. Ett bra tips är att först testa sina primers på material direkt från de arter man vill studera, eller från sådana man misstänker kan kontaminera proverna. På så sätt får man en uppfattning om hur bra ens primers fungerar och hur pass specifika de egentligen är.

Skulle man däremot råka blanda ihop prover som innehåller DNA från den organism man vill studera, är det mer problematiskt. Det är därför viktigt att använda sterila (engångs-)redskap i fält och hålla proverna isolerade från varandra. Kika gärna på våra förslag på utrustning att ta med i fältöppnas i nytt fönster

Vid analyser i labbet är en vanlig försiktighetsåtgärd att inkludera s.k. "blanka" prover. Dessa innehåller inte något provtaget material alls. Skulle man ändå får fram DNA från dessa, är det ett tecken på att kontaminering skett, och man bör i så fall göra om analysen.

 

Inhibitorer

Att man inte får fram något resultat i labbet är inte ovanligt, och det kan bero på många olika saker. Den allra vanligaste är att proverna helt enkelt inte innehåller något användbart DNA. Men andra faktorer kan också spela in, exempelvis kan olika substanser i proverna göra det svårt att utvinna DNA:t. Dessa substanser eller ämnen kallas "inhibitorer", eftersom de hindrar de biokemiska reaktioner som används för att extrahera och amplifiera DNA.

Oftast är det amplifieringen, d.v.s. PCR-reaktionenöppnas i nytt fönster, som påverkas. Resultatet blir "falskt negativt", eftersom det DNA som finns i provet inte går att kopiera och därmed inte heller att läsa av.


Humussyror är vanliga inhibitorer i miljöprover från sediment och vatten. Illustration: Erik Ersmark

Humussyror är vanliga inhibitorer i miljöprover från sediment och vatten. Illustration: Erik Ersmark

 

Material ute i fält kan vara fulla av inhibitorer, vilket är bra att vara medveten om när man tar miljöprover. Det kan röra sig om vitt skilda ämnen (exempelvis salter, metalljoner, tanniner och polysackarider). En vanlig inhibitor i miljö-prover från jord och vatten är s.k. humussyror. Dessa kännetecknas av brunaktig färg och förekommer rikligt i mossar och näringsfattiga sjöar.

Finns möjligheten att välja alternativa material, så är det en enkel lösning. Men det finns också sätt att bli av med inhibitorer i labbet. Det bästa sättet är att välja en metod som är speciellt anpassad till just det material man utgår från. För många material, som exempelvis vävnad, sediment eller spillning, finns färdiga kit att tillgå för att extrahera DNA. Kemikalerna i dessa kit tar inte bara fram DNA, utan rensar också vanligtvis bort eventuella inhibitorer. Ett bra tips är att ta reda på vilka metoder andra har använt för just det material som man ska arbeta med.

Om man ändå inte får fram något DNA med etablerade metoder, så kan det vara så att det fortfarande finns inhibitorer kvar i proverna. Man kan då försöka med att späda dessa, och/eller öka mängden polymeras, som är det verksamma enzymet i PCR-reaktionen. Att testa sina primers på "rent" material är också ett bra tips, så att man är säker på att de fungerar. 


Zombie-DNA

Zombie-DNA kanske låter påhittat, men det är i högsta grad verkligt. Det är helt enkelt vad vissa kallar DNA från döda organismer.

Zombie-DNA skulle man därmed också kunna kalla det DNA som finns bevarat i gamla lämningar som ben, skal och tänder. Men när man utvinner DNA från gamla ben, är man väl medveten om att det kommer från ett dött djur. Problemet uppstår när sådant DNA följer med i olika miljöprover i små välbevarade partiklar. När man sedan får fram DNA-sekvenserna, kan man felaktigt dra slutsatsen att organismen det tillhör fortfarande befinner sig i området där provet togs. Ju längre sen organismen dog, desto mer missvisande blir då resultatet.

 

Zombie-DNA. Illustration: Erik Ersmark

Illustration: Erik Ersmark

 

För att undvika den här sortens resultat som är "falskt positiva", måste man vara medveten om hur DNA bevaras och transporteras i olika material och miljöer. Som tur är bryts DNA ner tämligen snabbt ute i naturen, särskilt i vatten. Därför kan man oftast utgå från att det DNA man får fram faktiskt representerar levande organismer, eller åtminstone sådana som nyligen befunnit sig på platsen. I rinnande vatten eller vatten med strömmar finns också möjligheten att DNA:t kommer från platser långt från där provet tagits. 

När det gäller sediment, eller vatten som innehåller sediment, finns en större risk för zombie-DNA. I kalla syrefattiga miljöer kan DNA bevaras länge och i marken kan material med olika ålder ligga blandat. 

Om man mot förmodan lyckas ta reda på zombie-DNA:ts ålder, kan det faktiskt vara användbart. Man kan då ta reda på vilka organismer som funnits på en plats vid olika tidpunkter. Vid sådana analyser används beteckningen "ancient DNA" (aDNA), och det kan handla om DNA som är extremt gammalt. Faktum är att forskare har analyserat DNA från frusna sediment, och utifrån resultaten kunnat ge en bild av hur landskapet förändrats ända sedan den senaste istidenlänk till annan webbplats, öppnas i nytt fönster.

 

TILLBAKA